中国科学院、武漢ウイルス学研究所 Zhengli-Li Shi [ 石 正麗 (せき せいれい、シー・ジェンリー)］教授 & 米国ノースキャロライナ大学Ralph S. Baric教授の共同研究論文の和訳だよ。
【Google翻訳 & Sobokuによる和訳修正】
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循環するコウモリのコロナウイルスのSARS様クラスターはヒトへ感染する可能性を示す
原著論文タイトル：A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence
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方法
ウイルス、細胞、in vitro感染およびプラークアッセイ
野生型SARS-CoV（Urbani）、マウス適応型SARS-CoV（MA15）、およびキメラSARS様CoVは、ダルベッコの改良イーグルで増殖したVero E6細胞（米国陸軍感染症研究所から入手）で培養されました培地（DMEM）（ギブコ、カリフォルニア州）および5％胎児クローン血清（FCS）（ハイクローン、サウスローガン、ユタ州）および抗生物質/抗真菌薬（ギブコ、カリフォルニア州カールスバッド）ACE2オーソログ（相同分子種）を発現するDBT細胞（Baric実験室、出所不明）は、ヒトとジャコウネコの両方について以前に報告されています。bat Ace2配列はRhinolophus leschenaultiの配列に基づいており、bat Ace2を発現するDBT細胞は前述のように確立されました8。偽の実験は、HIVベースの偽ウイルスを用いたものと同様であった、前述のように調製し10、そして発現HeLa細胞（ウイルス学の武漢研究所）で調べACE2オルソログ（相同分子種）。HeLa細胞は、前述のように10% FCS（ギブコ、カリフォルニア州）を補充した最小必須培地（MEM）（ギブコ、カリフォルニア州）で増殖させた24。前述のようにVero E6、DBT、のCalu-3 2B4および初代ヒト気道上皮細胞における増殖曲線を行った8、25。ワーキングストックを作成するために使用された元のシードストックには汚染がありませんが、ワーキングセルラインストックは最近マイコプラズマについて認証またはテストされていません。HAE培養のためのヒト肺は、ノースカロライナ大学チャペルヒル施設内審査委員会承認プロトコルの下で調達されました。HAE培養は、繊毛および非繊毛上皮細胞および杯細胞を含む高度に分化したヒト気道上皮を表します。前述のように、培養物は使用前の数週間、気液界面でも成長します26。簡単に言えば、細胞をPBSで洗浄し、ウイルスを感染させるか、PBSで37℃で40分間模擬希釈しました。感染後、細胞を3回洗浄し、時間「0」を示すために新鮮な培地を加えた。記載された各時点で、3つ以上の生物学的複製が収集されました。サンプル収集では盲検化は使用されず、サンプルはランダム化されませんでした。すべてのウイルス培養は、グループ2が以前に説明したように、バイオセーフティキャビネットに冗長ファンを備えたバイオセーフティレベル（BSL）3の実験室で行われました。すべての要員は、タイベックのスーツ（感染症防護服）、エプロン、ブーティを備えた動力式空気清浄レスピレーター（Breathe Easy、3M）を着用し、二重手袋を着用していました。
シーケンスクラスタリングと構造モデリング
代表的なCoVのスパイクのS1ドメインの完全長ゲノム配列およびアミノ酸配列は、GenbankまたはPathosystems Resource Integration Center（PATRIC）からダウンロードされ、ClustalXに合わせて、100のブートストラップを使用するか、またはPhyMLを使用（https://code.google.com/p/phyml/）パッケージ。ツリーは、PhyMLパッケージで最尤法を使用して生成されました。スケールバーはヌクレオチド置換を表します。70％を超えるブートストラップをサポートするノードのみにラベルが付けられます。このツリーは、CoVがα-CoV、β-CoV、およびγ-CoVとして定義された3つの異なる系統発生グループに分割されていることを示しています。古典的なサブグループクラスターは、β-CoVの場合は2a、2b、2c、および2d、α-CoVの場合は1aおよび1bとしてマークされます。モデラー（Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit）を使用して構造モデルを生成し、結晶構造2AJF（Protein Data Bank）に基づいて、ACE2と複合したSARS RBDのSHC014およびRs3367のホモロジーモデルを生成しました。ホモロジーモデルは、MacPyMol（バージョン1.3）で視覚化および操作されました。
SARS様キメラウイルスの構築
野生型ウイルスとキメラウイルスの両方は、SARS-CoV Urbaniまたは対応するマウス適応（SARS-CoV MA15）感染性クローン（ic）のいずれかから派生しました27。SHC014のスパイク配列を含むプラスミドを制限消化により抽出し、MA15感染クローンのEおよびFプラスミドに連結しました。クローンは、ユニークなクラスII制限エンドヌクレアーゼ部位（BglI）が隣接する公開された配列を使用して、6つの連続したcDNAとして設計され、Bio Basicから購入しました。その後、野生型のキメラSARS-CoVおよびSHC014-CoVゲノム断片を含むプラスミドを増幅、切除、連結および精製した。次に、in vitro転写反応を行って全長ゲノムRNAを合成し、前述のようにVero E6細胞にトランスフェクトしました。2。トランスフェクトされた細胞からの培地を収穫し、その後の実験のシードストックとして役立てました。キメラウイルスおよび完全長ウイルスは、これらの研究で使用する前に配列分析により確認されました。キメラ変異体と完全長のSHC014-CoVの合成構築は、ノースカロライナ大学施設内バイオセーフティ委員会および懸念の二重使用研究委員会によって承認されました。
倫理声明
この研究は、NIHの実験動物福祉局（OLAW）による動物の世話と使用に関する推奨事項に従って実施されました。ノースカロライナ大学チャペルヒル校（UNC、許可番号A-3410-01）の施設内動物管理使用委員会（IACUC）は、これらの研究で使用される動物試験プロトコル（IACUC＃13-033）を承認しました。
マウスおよび生体内感染
雌、10週齢、12ヵ月齢のBALB / cAnNHsDマウスをHarlan Laboratoriesに注文しました。マウスの感染は前述のように行われました20。手短に言えば、動物をBSL3実験室に持ち込み、感染前に1週間順化させました。感染および弱毒生ウイルスワクチン接種のために、マウスをケタミンとキシラジンの混合物で麻酔し、チャレンジ（誘発）時に鼻腔内感染させ、50μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）または希釈したウイルスを各時点で3または4匹のマウスで図の凡例に記載されている用量ごとの感染グループ。個々のマウスの場合、全用量の吸入の失敗、鼻からの接種物の泡立ち、または口からの感染を含む感染の表記法により、研究者の裁量でマウスのデータが除外される可能性があります。感染後、他の事前に確立された除外または包含基準は定義されていません。動物実験では盲検化は使用されず、動物は無作為化されませんでした。予防接種については、若齢および高齢マウスに、ミョウバンまたは模擬PBSを含む0.2μgの二重不活化SARS-CoVワクチンの20μl容量をフットパッド注射でワクチン接種した。次に、22日後に同じレジメでマウスを追加免疫し、その後21日目にチャレンジしました。すべてのグループについて、プロトコルに従って、動物は実験期間中、病気の臨床徴候（ハンチング、毛羽立ち、活動低下）について毎日監視されました。最初の7日間は体重減少を毎日モニターし、その後、動物が最初の開始体重に回復するまで、または3日間連続して体重増加を表示するまで体重モニタリングを続けました。開始時の体重の20％以上を失ったすべてのマウスに地上給餌を行い、20％カットオフ未満である限り、1日に複数回さらにモニターしました。開始時の体重の30％以上を失ったマウスは、プロトコルに従って即座に安楽死しました。瀕死状態にある、または回復する可能性が低いと思われるマウスも、研究者の裁量で人道的に犠牲にされました。安楽死は、イソフルランの過剰摂取を使用して行われ、頸部脱臼により死亡が確認されました。すべてのマウス研究は、ノースカロライナ大学（動物福祉保証＃A3410-01）で、UNC機関動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルを使用して実施されました。
組織学的分析
左肺を摘出し、1週間膨張させずに10％緩衝ホルマリン（Fisher）に浸しました。組織をパラフィンに包埋し、UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center組織病理学コア施設によって5μm切片を調製しました。抗原染色の程度を決定するために、市販のポリクローナルSARS-CoV抗ヌクレオカプシド抗体（Imgenex）を使用してウイルス抗原について切片を染色し、前述のように気道および実質の染色について盲検法でスコアリングしました20。画像は、Olympus DP71カメラを備えたOlympus BX41顕微鏡を使用してキャプチャされました。
ウイルス中和アッセイ
前述のように、プラーク減少中和力価アッセイは、SARS-CoVのに対して、以前に特徴付けられた抗体を用いて実施した11、12、13。簡単に言えば、中和抗体または血清を2倍に連続希釈し、100 pfuの異なる感染性クローンSARS-CoV株と37℃で1時間インキュベートしました。次に、ウイルスと抗体を、5×105個のVero E6細胞/ウェルを含む6ウェルプレートに、複数の複製（n ≥ 2）。37°Cで1時間インキュベートした後、細胞に培地中の0.8％アガロース3mLを重ねました。プレートを37℃で2日間インキュベートし、ニュートラルレッドで3時間染色し、プラークをカウントしました。プラーク減少の割合は、（1 –（抗体を含むプラークの数/抗体を含まないプラークの数））×100として計算されました。
統計分析
すべての実験は、2つの実験グループ（2つのウイルス、またはワクチン接種コホートと非ワクチン接種コホート）を対比して実施されました。したがって、ウイルス力価と組織学スコアリングの有意差は、個々の時点での両側スチューデントのt検定によって決定されました。データは通常、比較される各グループに分散され、同様の分散がありました。
バイオセーフティとバイオセキュリティ
報告された研究は、ノースカロライナ大学施設内バイオセーフティ委員会が実験プロトコルを承認した後に開始されました（プロジェクトタイトル：コウモリSARS様CoVの感染性クローンの生成;ラボ安全計画ID：20145741;スケジュールG ID：12279）。これらの研究は、インフルエンザ、MERS、SARSウイルスを含む特定の機能獲得研究に関する米国政府の審議プロセス研究資金提供一時停止前に開始されました（http://www.phe.gov/s3/dualuse/Documents/gain-of-function .pdf）。このペーパーは、資金提供機関であるNIHによってレビューされました。これらの研究の継続が要求され、これはNIHによって承認されました。
SARS-CoVは厳選されたエージェントです。これらの研究のすべての作業は、SARS-CoV、MERs-CoV、およびその他の関連するCoVの承認された標準操作手順（SOP）および安全条件で実行されました。弊社の施設内CoV BSL3施設は、微生物および生物医学研究所（BMBL）のバイオセーフティ、米国保健福祉省、公衆衛生局、疾病管理センター（CDC）で推奨されている安全要件に適合するように設計されています。 ）およびNIH。研究所の安全計画が提出され、施設はUNC環境安全衛生局（EHS）とCDCによる使用が承認されました。施設への入場には、電子カードによるアクセスが必要です。すべての労働者は、電動空気清浄呼吸器（PAPR）を安全に使用するためにEHSによって訓練されています。BSL3施設での適切な作業習慣と積極的な医療監視計画が実施されています。CoV BSL3施設には冗長ファン、ファンへの非常用電源、生物学的安全キャビネットおよび冷凍庫が含まれ、施設はSealSafeマウスラックに対応できます。BSL3剤に分類される材料は、SARS-CoV、コウモリのCoV前駆体株、MERS-CoV、およびこれらの病原体に由来する変異体で構成されています。BSL3施設内では、認定されたクラスIIバイオセーフティキャビネット（BSC）で感染性ウイルスの実験が行われます。スタッフ全員がスクラブ、タイベックのスーツとエプロン、PAPRと靴カバーを着用し、両手は二重手袋です。BSL3ユーザーは、大学の従業員の健康管理クリニック（UEOHC）が監視する医療監視計画の対象となります。BSL3で働いている期間中のCoV感染に関連する症状の年次インフルエンザ予防接種と義務的な報告。すべてのBSL3ユーザーは、曝露管理および報告プロトコルの訓練を受けており、自己検疫の準備ができており、緊急事態の際に地元の感染症管理部門に安全に届けられるよう訓練されています。潜在的な暴露イベントはすべて、EHSとUEOHCによって報告および調査され、CDCとNIHの両方に報告されます。
2015年11月20日
最初にオンラインで公開されたこの記事のバージョンでは、著者はZ.-LSへの資金源であるEcoHealth AllianceからのUSAID-EPT-PREDICTの資金提供を承認するために省略しました。
引用アドレス：A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence. Nat Med. 2015 Dec;21(12):1508-13.
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